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Western Blot试验常见问题及解答 (Common Questions and Answers About WB) Author: GenAsia A. 对初学者看什么资料比较好？ 解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？ 解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？ 解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？ 解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。 E. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？ 解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？ 解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6％， Stacking Gel 3.5％。 G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。 解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5mm的 comb。 H. 蛋白变性后可以存放多久？ 解答：－ 80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。 I. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？ 解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。 J. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？ 解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点． K. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？ 解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。 L. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？ 解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。 M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？ 解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。 N. 有什么方法可以提高上样量？ 解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。 O. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？ 解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。 P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？ 解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3μg/mm2。 Q. 一抗，二抗的比例是否重要？ 解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。 3. 抗体做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？ 解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。 R. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？ 解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗） S. Western Blot 中抗体的重复应用问题 解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。 4. 滤纸、胶和膜的问题 T. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ 解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 U. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？ 解答：可以。 V. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？ 解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。 W. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？ 解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。 X. 采用tank system有什么讲究？ 解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。 Y. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？ 解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。 Z. 膜一般要如何处理？ 解答：一般用甲醇泡泡就可以了。 |